-------灵芝的化学成分( 三萜类化合物 )

灵芝类所含化学成分复杂，且因所用菌种培养方法、提取方法等不同而异。研究灵芝类的化学成分的目的，在于了解和比较灵芝属不同品种及同一品种的不同发育阶段（如子实体、菌丝体、孢子体）所含的化学成分，通过药理及临床研究确定其有效成分或有效部分。为进一步研究灵芝药理作用机制、提高临床疗效、改进生产工艺及质量控制标准提供理论根据。目前研究较多的灵芝化学成分有：三萜类化合物、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、无机元素、脂肪酸等。

三萜类化合物

三萜类化合物是灵芝的主要化学成分之一，灵芝中的很多三萜类化合物具有生理活性，如 ganoderic acid A. B. C.和D能够抑制小鼠肌肉细胞组胺的释放。ganoderic acid F有很强的抑制血管紧张素酶的活性。赤芝孢子酸A对CCl 4 和半乳糖胺及丙酸杆菌造成的小鼠转氮酶升高均有降低作用。赤芝孢子内酯A具有降低胆固醇作用。因此对 三萜类化合物的进一步深入研究将有利于灵芝有效成分的寻找和进一步阐明其生理活性。

1982 年 Kubota. T等人首次从赤芝子实体中分离得到 三萜类化合物，此后十年来，对三萜类化合物研究最多的是日本，其次是中国（包括台湾）。到目前为止已先后从赤芝子实体和孢子粉中分到了 103 种新的三萜类化学成分

一、三萜类化合物提取和分离

灵芝中三萜类化合物的提取分离方法可以分为三类，一类是用甲醇或者乙醇提取原料，提取物直接进行层析分离，如 H. Konda等用甲醇提取原料，提取物浓缩后悬浮于水，依次用已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分经硅胶色谱、高效液相层析（HPLC）分到四个三萜酸。第二类方法是用甲醇、乙醇等提取原料，然后分出总酸部分，进行分离，如Morigiwa等人用70%甲醇提取原料，提取物用1mol/L HCl调pH2~3，再用乙酸乙酯萃取，浓缩后进行分离，分到五个 三萜类化合物。 Nishitoba等人用乙醇提取原料，提取物浓缩后在水和CHCl 3 中进行分配， CHCl 3 层浓缩至一定体积后，用饱和的 NaHCO 3 水溶液萃取，萃取物用 6mol/L HCl酸化到pH3~4，水溶液中出现的沉淀以CHCl 3 溶解，干燥后得总酸提取物，经硅胶柱层析分到五个三萜类化合物。第三类方法是利用制备衍生物的方法进行分离，如 KiKuchi等用乙醚提取原料，其酸性部分用重氮甲烷进行甲基化，然后再在硅胶柱上进行分离，从中分到七个三萜酸。Hirotani等用90%MeOH-H 2 O提取，提取液减压浓缩后加入5%Na 2 CO 3 水溶液碱化至 pH9，然后用CHCl 3 萃取，水层用 4mol/L H 2 SO 4 酸化至 pH2，再用CHCl 3 萃取， CHCl 3 萃取液用水洗， Na 2 SO 4 干燥，浓缩后得总酸部分，该部分再以常规方法用重氮甲烷进行甲酯化，硅胶柱色谱，得到三个新的三萜酸。

灵芝中三萜化合物的分离大多是经过反复硅胶柱层析，较纯的部分薄层、低压柱，高效液相色谱（正反相）制备等方法进行分离纯化。硅胶柱色谱一般常用的展开剂为 MeOH-CHCl 3 ， EtAc-C 6 H 6 ， EtoAc-acetone，EtOAc-CHCl 3 ， CHCl 3 -MeOH-H 2 O等系统。HPLC多用乙腈—乙酸铵缓冲溶液以及MeOH-H 2 O洗脱。薄层检查一般使用的展开剂为CHCl 3 -MeOH（95∶5，9∶1V/V）或苯—乙酸乙酯（3∶7V/V），香兰醛-硫酸做为薄层斑点的显色剂。

我们曾从赤芝孢子粉酸性脂溶部分中分到七个 三萜类化合物，其中五个四环三萜酸，一个四环三萜醇，二个五环三萜内酯化合物，并对它们的结构进行了测定证明有三个新化合物，其余均为首次从赤芝孢子粉中分离出来。下面是三萜类化合物提取分离流程。

二、三萜类化合物的结构测定

（一）三萜类化合物的结构特点

灵芝三萜类化合物分为四环三萜和五环三萜。从灵芝四环三萜类化合物的结构来看，属于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子数可分为 C 30 ， C 27 和 C 24 三大类，根据其所含功能团和不同的侧链可有以下六种基本骨架。

在三萜酸的结构中，环上的双键大多位于△ 8 （ 9 ） 位，在 C 11 位和 C 23 位大部分有羰基，而且在 C 3 、 C 7 、 C 15 位也多被羟基或羰基所取代。在三萜醇、醛和过氧化物的结构中环上大多存在两个不饱和双键，其位置在△ 7 （ 8 ） ，△ 9 （ 11 ） 位， C 11 位和 C 23 位也不存在羰基而且环上的取代基明显减少。表 6-1 列出了迄今为止分到的所有灵芝三萜化合物。目前灵芝三萜化合物的命名有些混乱，同一化合物有不同的名称，对此我们采用最早的命名。

（二）三萜类化合物的光谱特征

1. 红外光谱 : 灵芝中的三萜类化合物大多都有羟基 , 因而在 3300cm -1 ， 1050 cm -1 有强的羟基吸收峰。三萜酸类化合物在 2600 ～ 2400cm -1 有弱吸收峰，当羧酸被酯化以后这一吸收峰消失。在 C 15 位有羰基的化合物在 1740 ～ 1760cm -1 会出现五元环酮的吸收特征峰。在 1720cm -1 （酯）， 1710cm -1 （六元环酮）， 1650cm -1 （α、β不饱和酮）也有较强的吸收峰。

2. 紫外光谱：由于灵芝中的三萜类化合物大多都有共轭体系存在，因而紫外吸收波长和强度也很有规律，凡在 C 11 位存在羰基的化合物都存在着△ 8 （ 9 ） 双键，这类化合物的紫外吸收大多在λ max 253nm ， log ε在 3.8 ～ 4.1 之间，而 C 11 位没有羰基的化合物，大多存在着△ 7 （ 8 ） 、△ 9 （ 11 ） 共轭双键，因而紫外吸收在λ max 237nm ， 244nm ， 253nm 有三个吸收峰，而吸收强度大多在 log ε 3.7 ～ 4.1 之间。而在既没有α、β不饱和酮，又没有共轭双键的化合物中，紫外光谱仅表现简单的双键末端吸收在λ max 210nm log ε 4.2 左右。

3. 质谱：四环三萜化合物质谱裂解的共同特征是失去侧键。羊毛甾烷类的特征裂解是从 D 环断裂，伴有一个质子的转移，然后经第二次裂解失去侧链和 D 环的一部分。 Kikuchi [11] 在这方面作了很多研究，总结出这类化合物的裂解方式大致如下：

4 . 核磁共振谱：三萜类化合物的 1HNMR 中主要信号是双键质子，连氧碳质子和甲基质子（见表 6-2 ）。环内双键质子的δ值一般大于 5 × 10 -6 ，在灵芝三萜化合物中，如 ganoderic acid R. S. T. X. Y. Me等的双键位置在 △ 7 （ 8 ） 和△ 9 （ 11 ） ， 7 位质子的δ值在（ 5.48 ～ 5.86) × 10 -6 之间 ,11 位质子的δ值比 7 位要处于高场 , 在δ (5.31 ～ 5.39 ）× 10 -6 之间，侧链上双键的位置可分为二类，一类在△ 20 （ 22 ） ， 20 位质子的信号在δ（ 6.04 ～ 6.12) × 10 -6 ，如 ganoderenic acid A.B.C.D等。另一类在 △ 24 （ 25 ） ， 24 位质子的信号在δ（ 5.4 ～ 5.7 ）× 10 -6 ，如 ganoderol A和B。

连氧碳质子由于位置、环境和构型的不同，其化学位移变化较大。在 C 3 、 C 7 、 C 12 、 C 15 为羟基取代的化合物中由于羟基构型不同，该碳所连接 H 的化学位移值和偶合常数也不同， 3 — H 多为α构型，δ值在 (3.22 ～ 3.31) × 10 -6 ， J=10Hz ， 7 — H 为α构型时δ：（ 4.75 ～ 4.85) × 10 -6 ， J=9Hz ， 7 — H 为β构型时，δ：（ 4.4 ～ 4.5) × 10 -6 ， J=5Hz 。 12 — H 多为α构型，δ：（ 4.5 ～ 4.9) × 10 -6 。 15 — H 多为β构型，δ（ 4.2 ～ 4.90) × 10 -6 。三萜中的甲基信号上有较多的取代基，对甲基的化学位移影响较大。 18 — CH 3 通常在δ（ 0.95 ～ 1.0) × 10 -6 之间，当分子中存在△ 7 （ 8 ） 、△ 9 （ 11 ） 共轭双键时，该甲基信号向高场位移至δ（ 0.55 ～ 0.60) × 10 -6 ，当 12 位有羟基取代时，该信号出现在δ 0.85 × 10 -6 左右。 21 — CH 3 信号通常出现在δ（ 0.85 ～ 1.0 ）× 10 -6 之间，为双峰，但当 20 位有羟基取代时，该信号向低场位移，出现在δ（ 1.4 ～ 1.6 ）× 10 -6 ，当存在△ 20 （ 22 ） 双键时，该信号出现在δ 2.1 × 10 -6 ，且都为单峰。 27 — CH 3 通常出现在δ（ 1.1 ～ 1.2 ）× 10 -6 ，当存在△ 24 （ 25 ） 双键时，该甲基信号在δ 1.6 × 10 -6 左右。 32 — CH 3 受 7 位和 15 位取代基的影响较大。当 7 位和 15 位同时被羰基取代时，该号在δ（ 1.6 ～ 1.8 ）× 10 -6 之间，当 7 位和 15 位均为羟基或一个羟基一个羰基时则无明显变化均出现在δ（ 1.2 ～ 1.3 ）× 10 -6 之间，当 7 位和 15 位无取代基时，该甲基信号则出现在δ 0.88 × 10 -6 左右。 30 — CH 3 和 31 — CH 3 受 3 位取代基影响较大，当 3 位是羟基时 30 — CH 3 在δ 1.0 × 10 -6 左右， 31 — CH 3 在δ 0.85 × 10 -6 左右。当 3 位是羰基时， 17 — H 在δ 1.8 × 10 -6 左右，而当 15 位是羰基时 17 — H 向低场移至δ 2.2 × 10 -6 左右。从 17 — H 的位置可以判断 C 15 位所连接的基团。

13 CNMR 的运用使得化合物基本骨架的确定日趋准确。三萜化合物的碳谱中最容易分辨的信号来自双键碳原子和连氧碳原子。前面提过灵芝三萜母核上的双键位置有两类，在△ 8 （ 9 ） 这类化合物中， C 8 在δ（ 151 ～ 160 ）× 10 -6 ， C 9 在δ（ 140 ～ 146 ）× 10 -6 ，在△ 7 （ 8 ） 和△ 9 （ 11 ） 这类化合物中 C 7 在δ（ 120 ～ 121 ）× 10 -6 ， C 8 在δ（ 140 ～ 142 ）× 10 -6 ， C 9 在δ（ 141 ～ 145 ）× 10 -6 ， C 11 在δ（ 115 ～ 117 ）× 10 -6 。侧链上的双键位置也有两类，一类是△ 20 （ 22 ） ， C 20 在δ（ 154 ～ 157 ）× 10 -6 ， C 22 在δ（ 124.3 ～ 124.7 ）× 10 -6 ；另一类是△ 24 （ 25 ） ， C 24 在δ（ 139 ～ 145 ）× 10 -6 ， C 25 在δ（ 126 ～ 129 ）× 10 -6 。当下列各碳连有羟基时，它们的化学位移值分别为 C 3 δ（ 77 ～ 79 ）× 10 -6 ， C 7 δ（ 66 ～ 68 ）× 10 -6 ， C 12 δ（ 77 ～ 79 ）× 10 -6 ， C 15 δ（ 72 ～ 74 ）× 10 -6 。当下列各碳连有羰基时，它们的化学位移值分别为 C 3 δ（ 215 ～ 216 ）× 10 -6 ， C 7 δ（ 198 ～ 200 ）× 10 -6 ， C 15 δ（ 205 ～ 217 ）× 10 -6 ， C 23 δ（ 207 ～ 208 ）× 10 -6 。羧酸酯的化学位移在δ（ 170 ～ 178 ）× 10 -6 。 C 3 、 C 7 、 C 15 取代基不同时， C 1 在δ（ 35 ～ 37 ）× 10 -6 ， C 2 在δ（ 34.1 ～ 34.8 ）× 10 -6 ， C 4 在δ（ 46 ～ 47 ）× 10 -6 ，当 C 3 连接的是羟基时，这三个碳的信号均向高场位移， C 1 在δ 34 × 10 -6 ， C 2 δ 27 × 10 -6 ， C 4 δ 38 × 10 -6 左右。 C 7 是羰基取代时 C 6 在δ（ 33 ～ 37 ）× 10 -6 ， C 7 是羟基取代时 C 6 在δ（ 26 ～ 28 ）× 10 -6 。 C 15 是羰基时 C 14 在δ（ 57 ～ 59 ）× 10 -6 ， C 15 是羟基时， C 14 在δ（ 52 ～ 53 ）× 10 -6 。

近年来发展起来的 1 H — 1 H 和 1 H — 13 C COSY 等二维核磁共振谱已应用在灵芝三萜结构的测定中。

5. 旋光光谱：旋光光谱主要是解决绝对构型问题，从文献报道的 CD 谱数据总结出 CD 谱与绝对构型关系；凡是具有 [I] 式绝对构型者， C 7 为羟基，不管 3 位或 15 位是羟基或羰基取代， CD 谱都呈现下列 Cotton效应，（290～295）nm（—），（248～257）nm（+），（207～217）nm（—）；凡是在[I]式结构中C 7 为酮基者，则不管3位或15位的取代基如何，都呈现如下Cotton效应：（305～307）nm（—），（272～278）nm（+），（253～256）nm（—），（225～231）nm（+）。

Nishitoba等人在鉴定epoxyganoderiol A的绝对构型时，应用CD谱确定了C 24 和C 25 的绝对构型。在epoxyganoderiol A的侧链上存在着一个环氧基团，为了确定24和25位是S还是R，首先以羊毛甾醇为原料，经反应得到S和R两种构型的化合物，反应如下：

a)AC 2 O/pyridine, b) SeO 2 /dioxane, c) NaBH 4 /CeCl 3 ·7H 2 O/MeOH-THF

d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH 2 Cl 2

分别将 7b和7a溶于CCl 4 溶液中，加入Eu（fod） 3 络合物，测其旋光谱，得到如下结果：

以上两个化合物的 CD谱的Cotton效应是与C 25 的Newman投影相一致的。正Cotton效应为25S负Cotton效应为25R。在相同条件下测epoxyganoderiol A的CD谱，显示313nm（ △ε +10.9 ）为正 Cotton效应，证明25位的绝对构型为S，通过测定NOE，证实24位绝对构型为S。

（三）结构测定中的化学反应

随着仪器分析新技术、新方法的发展，各类谱学方法和 X射线—衍射等分析手段已在结构测定中得到了广泛的应用。经典的化学方法与仪器分析相结合，使三萜化合物的结构测定快速而准确并达到了微量的水平。化学反应常用于证实分子骨架中取代基类型、数目、位置及构型等。

1 . 氧化反应 氧化反应主要用来确定分子中所含羟基、羰基或酰基的数目和位置等。应用较多的是将羟基氧化成羰基，比较常用的是铬酐—吡啶的方法，也有将铬酐溶于 AcOH 中搅拌加入样品中，室温下搅拌 2h ，用水稀释，氯仿提取，提取液经水洗干燥浓缩后经薄层制备而得到氧化产物。

2. 酰化反应 酰化反应对于确定分子中羟基的数目、性质、构型很有帮助，常用的乙酰化反应，通常采用醋酐—吡啶室温处理的方法。

3. 水解 由于部分灵芝三萜酸中带有乙酰基，为确定乙酰基的存在和数目，采用了水解的方法，如 Komoda将ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na 2 CO 3 室温处理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl 3 萃取，水洗CHCl 3 液后Na 2 SO 4 干燥，蒸干。通过TLC制备得水解产物。

4 . 还原 还原反应主要用来确定分子中有无不饱和双键及羟基、羰基、取代基的位置。如 Nishitoba等人在确定lucidenato G结构时，为了证实C 26 位上存在着羟基，先将lucidenate G甲基化，然后再用NaBH 4 进行还原，得到其丙酮化物，从而证实了C 26 位存在着一个羟基。